Baillie Gifford flaggar upp i den svenska streamingtjänsten, enligt handlingar registrerade hos den amerikanska finansinspektionen SEC.
Fondförvaltaren äger per den 16 januari 9,7 procent av Spotify, en post som vid onsdagens stängning på Wall Street var värd 2,4 miljarder dollar, motsvarande 21,7 miljarder kronor.
Därmed går Baillie Gifford såväl Daniel Ek som kinesiska Tencent och blir Spotifys näst största ägare. Störst är fortfarande Martin Lorentzon, med 12 procent av aktierna, enligt Bloomberg.
Strax över hälften av Baillie Giffords innehav är direktägda aktier som medför rösträtt, enligt handlingarna.
Spotifys grundarpar har dock säkrat sin kontroll över bolaget. Daniel Ek röstar redan för storägarna Tencent och Tiger Global. Bolaget kunde vid noteringen förra året dessutom utfärda certifikat som höjer hans och Martin Lorentzons andel av rösterna till 80 procent.
Spotifys aktiekurs har dalade under hösten och nådde sin lägsta stängningskurs hittills den 21 december, på 106,84 dollar. Det var 28 procent längre än efter den första handelsdagen i början av april.
Läs mer: Nytt EU-direktiv sätter skräck i Spotify
Under januari har aktien återhämtat sig. På onsdagen stod kursen i 134,25 dollar vid stängning, vilket gav ett börsvärde på 24,3 miljarder dollar, eller 219 miljarder kronor. Det är dock en bit under nivåerna i juli och augusti, då aktiekursen låg strax under 200 dollar.
Di Digital rapporterade i oktober att Spotifys grundare hade sålt aktier för drygt 1 miljard kronor sedan noteringen i april. Då planerade båda att sälja aktier för knappt 1 miljard kronor till. Det är dock oklart om de har fullbordat sin planerade försäljning.
De första riskkapitalbolagen som investerade i Spotify, Northzone och Creandum, sålde under 2018 den största delen av sina innehav i bolaget. Investeringen gav de två omkring 25 miljarder kronor i avkastning, uppgav de i december för Di Digital.
Spotify presenterar siffrorna för sitt fjärde kvartal den 7 februari.